龙舟竞渡与祭祀屈原
網站地圖 聯系我們搜索內部網English | 中國科學院
首頁 所況簡介 機構設置 科研隊伍 科學研究平臺 院地合作 黨群園地 國際交流 博士后 研究生教育 信息公開
科研進展
成果報道
最新重要論文(影響因子PNAS及以上)
發表論文數據庫
所級學術報告
科學成果
發表論文
專著
專利
獲獎
專題
所史叢書
所慶專輯
建所50周年畫冊
現在位置:首頁 > 科研進展 > 成果報道
王艷麗組揭示Cas9切割DNA及其被AcrIIC3抑制的分子機理
2019-10-25 | 【     】【打印】【關閉

  CRISPR/Cas系統是廣泛存在于細菌和古菌中抵抗病毒、質粒等外源核酸的獲得性免疫系統。II型的Cas9在RNA的介導下可以特異性的識別、切割dsDNA,具有可編輯性。因此被廣泛用作基因編輯工具。由于其重要性,Cas9被系統地研究,大量的文獻報道了Cas9的原子分辨率結構、單分子測量結果、分子動力學模擬計算結果,闡明了Cas9切割DNA的分子機理。但是,之前發表的Cas9結構中,切割目的DNA的HNH催化口袋遠離切割位點,Cas9處于非活性的狀態。而活性狀態下的結構是真正理解Cas9切割DNA的作用機制所必需的。另外,目前被廣泛使用的SpyCas9,因受其大小的限制,很難與sgRNA一起通過單一AAV病毒導入。而近年來新鑒定的NmeCas9則由于其相對比較小和脫靶率低的原因,有望成為一個更好的編輯工具,但其分子機制尚未被揭示。

  噬菌體編碼的具有抑制CRISPR-Cas系統功能的蛋白被稱為anti-CRISPR蛋白,這些蛋白可以作為基因編輯開關,調控Cas9的活性。2016年,多倫多大學的Karen Maxwell課題組首次報道了AcrIIC1、AcrIIC2和AcrIIC3三種可以抑制NmeCas9的anti-CRISPR蛋白。王艷麗課題組曾與Maxwell課題組合作闡明了AcrIIC2通過阻礙Cas9與sgRNA的結合抑制Cas9活性的機制;但是目前AcrIIC3的抑制機理還不清楚。

  2019年10月24日,王艷麗課題組的研究論文“Structures of Neisseria meningitidis Cas9 Complexes in Catalytically Poised and Anti-CRISPR Inhibited States”在《Molecular Cell》雜志在線發表。該工作報道了NmeCas9的五種不同的狀態:sgRNA結合狀態、種子區域配對狀態、催化前狀態、催化狀態、切割后產物結合狀態的高分辨率結構。這些結構如同電影一樣,逐步展示了Cas9切割目的DNA的每一個過程,同時揭示了兩種不同的NmeCas9識別兩種不同PAM的分子機制,進一步揭示了Cas9切割DNA的分子機制。同時,該工作還報道了AcrIIC3分別與sgRNA結合狀態、DNA結合狀態Nme1Cas9的復合物結構,揭示了AcrIIC3抑制Nme1Cas9切割活性的分子機理。

  Cas9與sgRNA結合形成功能復合物,然后Cas9-sgRNA復合物讀取目標DNA的PAM序列,解開目的DNA雙螺旋,同時sgRNA和目的DNA配對,產生R-loop,隨后Cas9的HNH與RuvC活性中心分別切斷DNA的兩條鏈。本研究中的種子區域配對狀態的結構,成功捕捉到雙螺旋形成的中間過程,即sgRNA識別、結合目的DNA的狀態(圖1A)。更值得注意的是研究者解析了Cas9 HNH處于催化狀態的結構(圖1B),并第一次觀察到金屬離子與HNH活性中心的結合。而上述這兩種狀態是首次被觀測到。

  Cas9的HNH結構域具有非常高的柔性,并傾向處于遠離切割位點的部位,使得Cas9易處于非活性狀態。研究者對HNH結構域進行改造,增強了HNH結構域與目的DNA的相互作用,提高了NmeCas9切割DNA的活性。同時,HNH的催化狀態激活RuvC切割另一DNA鏈的活性。因此,HNH結構域改造后的Cas9切割目的DNA兩條鏈的活性同時得到增強。

  為了闡明AcrIIC3抑制NmeCas9活性的分子機理,研究者解析了AcrIIC3和結合sgRNA的NmeCas9形成復合物的結構,以及和結合了sgRNA、DNA的NmeCas9形成復合物的結構。研究表明,兩個AcrIIC3單體連接兩個NmeCas9復合物(圖1C)。AcrIIC3與NmeCas9之間的相互作用將HNH結構域錨定在非活性狀態,從而抑制NmeCas9對DNA的切割。

  圖1. NmeCas9-sgRNA-DNA復合物三種不同狀態的晶體結構。

  A. 種子區域配對狀態;B.催化狀態;C. AcrIIC3抑制狀態。

  這項工作還給大家展示了兩種NmeCas9切割DNA的中間狀態以及產物結合狀態,進一步闡述了Cas9切割DNA的分子機理。需要指出的是,在論文評審過程中,《Nature Structural & Molecular Biology》雜志報道了處于切割后狀態的SpyCas9三元復合物結構,整體分辨率3.37angstrom,但是局部的HNH分辨率比較低。王艷麗組報道的催化狀態中Cas9三元復合物結構的分辨率更高,為Cas9的改造與應用提供了更有力的理論基礎;同時揭示了AcrIIC3抑制NmeCas9切割雙鏈DNA的分子機理 (圖2)。

  中國科學院生物物理所王艷麗研究員和美國麻省大學醫學院Erik Sontheimer教授為本文的共同通訊作者。王艷麗課題組的孫偉、楊晶、程志為本文的共同第一作者。該研究得到科技部、國家自然科學基金以及中國科學院的資助,上海同步輻射光源(SSRF)及日本同步輻射光源(SPring-8)為該研究提供了重要的技術支持。

  圖2. NmeCas9切割DNA以及受AcrIIC3抑制的模型。

  文章鏈接:https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(19)30730-0 

  (供稿:王艷麗研究組)

評 論
·王艷麗課題組在Agos蛋白指導導向DNA鏈切割靶標DNA鏈的機制研究上取得進展
·法國巴黎高等師范學院Strick教授來訪生物物理所并做“貝時璋報告”
·朱冰課題組揭示卵子獨特表觀遺傳狀態的建立機制及其對生育能力的影響
·生物物理所研究人員揭示轉錄因子STAT6特異識別N4位點DNA的分子機制
·生物物理所研究人員在《PNAS》上發表文章揭示轉錄因子STAT6特異識別N4位點DNA的分子機制
·哈佛大學醫學院張毅教授來訪生物物理所并作貝時璋報告
·李國紅課題組和物理所合作利用單分子技術揭示FACT對核小體結構調控的分子機制
·生物物理所合作團隊解析III-A型CRISPR-Cas效應復合物原子分辨率電鏡結構
·美國國家科學院院士謝曉亮來訪生物物理所并做“貝時璋講座”報告
·Nature Methods:徐濤院士組與科學研究平臺研發團隊實現分子尺度分辨率光學成像
·生物物理所研制出分子尺度分辨率干涉定位顯微鏡(徐濤和科研平臺紀偉的推送院里的稿件)
·許瑞明課題組揭示組蛋白乙酰轉移酶活性調節的新機制
·朱冰課題組發現維持DNA甲基化基因沉默的新機制
·首都醫科大學尚永豐教授來訪生物物理所并做“貝時璋講座”報告
·王艷麗組揭示噬菌體防御CRISPR-SpyCas9的分子機制
·生物物理所團隊揭示綠藻光系統I高效捕獲及傳遞光能的分子機制
·王艷麗組和章新政組合作揭示III型CRISPR-Cas系統免疫機制
·植物的光適應與捕光調節機制:光合作用狀態轉換復合體結構
·饒子和/王祥喜研究團隊合作解析單純皰疹病毒2型成熟核衣殼高分辨率三維結構,揭示皰疹病毒的組裝和穩定性機制
·王江云組和孫金鵬、劉愛民組合作在 Nature Chemical Biology發表系列論文,闡明基因編碼的二氟代酪氨酸在膜蛋白、酶催化機理方面的應用
·內核膜蛋白SUN1調控HIV-1的入核
·生物物理所周政組揭示Chz1識別并組裝H2A.Z的分子機制
·我心中的生物物理所[赫榮喬]
·王艷麗組揭示anti-CRISPR沉默CRISPR-Cas9系統的分子機理
·俞洋課題組和上海生化細胞所黃旲課題組合作發現PANDAS復合物在piRNA調控異染色質形成的分子機制(俞洋課題組推送院里的稿件,標題稍作修改)
·四篇文章背靠背,俞洋/黃旲組精誠合作殺出重圍,首次發現PANDAS復合物在piRNA調控異染色質形成的分子機制
·靶向腫瘤的免疫檢查點抑制劑
·果蠅嗅覺學習記憶中的去抑制神經環路機制
·馮巍課題組揭示驅動蛋白kinesin-3自抑制的分子機制
·婁繼忠課題組與浙江大學、清華大學合作揭示紅斑狼瘡疾病相關FcγRIIB-I232T變異體功能喪失的全新分子機制
·王曉群課題組與北京大學和首都醫科大學合作共同繪制人腦前額葉發育的單細胞圖譜
·周政課題組揭示TIRR抑制53BP1識別H4K20me2的分子機制
·高光俠研究組發現宿主抑制病毒蛋白質合成重編碼的新機制
·卜鵬程課題組和杜克大學合作者發現靶向果糖代謝能有效抑制結直腸癌肝轉移
·王志珍課題組報道靶向內質網蛋白質氧化折疊通路治療宮頸癌的新策略
·馮巍課題組和楊福愉課題組合作揭示YWHA/14-3-3結合并調控轉錄因子TFEB功能的分子機制
·中國科學院生物大分子卓越創新中心核心骨干成員增選通知
           
版權所有:中國科學院生物物理研究所     京ICP備05002792號 京公網安備 110402500011 號
地址:北京市朝陽區大屯路15號(100101) 電話:010-64889872
意見反饋聯系人:侯文茹 電子郵件:[email protected]
龙舟竞渡与祭祀屈原 846920196485367565855685962674570913520469786919776683725844287062879072524448086444664683371878728 (function(){ var bp = document.createElement('script'); var curProtocol = window.location.protocol.split(':')[0]; if (curProtocol === 'https') { bp.src = 'https://zz.bdstatic.com/linksubmit/push.js'; } else { bp.src = 'http://push.zhanzhang.baidu.com/push.js'; } var s = document.getElementsByTagName("script")[0]; s.parentNode.insertBefore(bp, s); })();